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2023年11月16日 13:42 來(lái)源：新維創(chuàng)生物科技（重慶）有限公司
用于抗體標(biāo)記的熒光素主要有異硫氰酸熒光素(Fluorescein isothiocynate,FITC）。在堿條件下FITC的碳酰胺鍵可與抗體賴氨酸的ε氨基共價(jià)結(jié)合，標(biāo)記后的抗體仍保持與相應(yīng)抗原結(jié)合的能力。在熒光燈源紫外線或蘭紫光激發(fā)下產(chǎn)生黃綠色熒光，通過(guò)在熒光顯微鏡下觀察或流式細(xì)胞儀分析可對(duì)相應(yīng)抗原進(jìn)行定性、定位或定量的檢測(cè)。
實(shí)驗(yàn)材料準(zhǔn)備：
1.純化的多克隆抗體或單克隆抗體。
2.FITC(Fluorescein-5-Lsothiocyanalte)或其它熒光色素。
3.PBS、DMSO
4.PH9～9.5碳酸鹽緩沖液: Na2CO34.3g，NaHCO3 8.6g加蒸餾水至500ml。
5.PD10柱(Sephadex G25柱)
磁力攪拌器，紫外分光光度計(jì)等
操作步驟
1.將純化的IgG抗體對(duì)PH9～9.5碳酸鹽緩沖液透析過(guò)夜，透析后抗體液移入小燒杯中
2.稱取適量IFTC，加入二甲亞砜(DMSO)(FITC～1mg/1ml DMSO)使終濃度為1mgFITC／1mlDMSO
FITC／IgG比例:如IgG濃度為1mg／ml，F(xiàn)ITC／IgG比例約為50μgFITC／mgIgG；
如IgG為5～10mg／ml，則比例為25μgFITC／ml IgG
在10ml小燒杯中先放入抗體
3.按上述比例將FITC-DMSO溶液逐滴加入透析后的抗體溶液中
4.將標(biāo)記物用PBS加至2.5ml，磁力攪拌器室溫下避光攪拌2h
5.用PD10柱(Sephadex G25柱)除去游離熒光素，先用25ml PBS淋洗G25柱
6.收集PBS洗脫第一個(gè)熒光素結(jié)合蛋白峰，測(cè)定F／P比值。第二個(gè)熒光素峰為游離熒光素
注意事項(xiàng)
1.FITC保存于4℃暗處，使用前待試劑瓶升至室溫時(shí)開(kāi)蓋稱取，以避免潮解。
2.FITC-DMSO液要臨用時(shí)配制。
3.碳酸鹽緩沖液要新鮮配制。
日期：2023-11-16
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