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2023年12月13日 11:21 來(lái)源：新維創(chuàng)生物科技（重慶）有限公司
FITC抗體標(biāo)記實(shí)驗(yàn)熒光素標(biāo)記抗體步驟
準(zhǔn)備好凝膠濾柱以便完成結(jié)合反應(yīng)后用于分離標(biāo)記抗體和游離的熒光色素。分離球形蛋白使用排除極限為 20000 ～ 50000 的凝膠介質(zhì)和細(xì)粒級(jí)凝膠（直徑約 50 μm ）。所需凝膠濾柱的大小可根據(jù)偶聯(lián)反應(yīng)的總體積× 20 來(lái)確定。依據(jù)廠家說(shuō)明準(zhǔn)備好濾柱，用 20 倍柱床體積的 PBS 灌注濾柱，直至緩沖液水平剛好降至低于柱床頂部，關(guān)閉濾紙底部的閥門(mén)或用塑膜黏土（或parafilm）封閉底端以使濾柱不再流動(dòng)。
用0.1mol/L 的硼酸鈉或碳酸鈉配制濃度至少為2mg/ml 的抗體溶液（pH9.0）。應(yīng)避免引入含一級(jí)胺的外來(lái)分子。
用無(wú)水 DMSO（優(yōu)級(jí)純）溶解 FITC 至 1mg/ml 。每次標(biāo)記反應(yīng)時(shí)新鮮配制。
每 1ml 蛋白溶液加 50 μL染液。染液須以每次 5 μL緩慢加入，加入時(shí)應(yīng)輕輕地連續(xù)攪拌混勻。
置 4℃避光反應(yīng)1h 。
加氯化銨至 50mmol/L ，室溫孵育 2h 。加入 0.1％二甲苯氰和 5％甘油。
通過(guò)凝膠過(guò)濾分離結(jié)合物與未結(jié)合的染料。小心地將偶聯(lián)反應(yīng)產(chǎn)物加在濾柱頂部，打開(kāi)閥門(mén)使抗體溶液流過(guò)濾柱直至剛好進(jìn)入柱床。再小心地將 PBS 加在濾柱頂部并與緩沖液供應(yīng)裝置連接。結(jié)合染料的抗體首先洗脫，通常可在室光下見(jiàn)到。
將洗脫液的結(jié)合物 4℃貯存于避光容器，必要時(shí)加入 0.02％疊氮鈉。
進(jìn)行熒光素偶聯(lián)反應(yīng)時(shí)，應(yīng)通過(guò)測(cè)量 495nm 和 280nm 波長(zhǎng)的吸光值計(jì)算熒光素和蛋白的比率，羅丹明的測(cè)量波長(zhǎng)在 550nm 和 280nm 。熒光素的吸光值比例（496nm/280nm）應(yīng)在0.3 ～ 1.0之間，低于上述比率將導(dǎo)致低信號(hào)，高比率則出現(xiàn)高背景。若比率太低，應(yīng)使用低濃度抗體與高濃度染料重復(fù)結(jié)合；若比率太高，則可適當(dāng)調(diào)整后重新標(biāo)記，或通過(guò) DEAE 離子交換層析柱進(jìn)一步純化抗體。用 10mmol/L 磷酸鉀（ pH8.0 ）平衡并灌注濾柱，通過(guò)增加鹽濃度進(jìn)行梯度洗脫。測(cè)量每一組分的吸光值比率（495/280 或 550/280），選取適當(dāng)組分合并。
新維創(chuàng)生物科技（重慶）有限公司
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