Ex/Em：494/520 nm異硫氰酸熒光素FITC標(biāo)記蛋白使用方法

異硫氰酸熒光素，具有高吸收率、優(yōu)良的熒光量子產(chǎn)率和良好的水溶性等特點，是生物學(xué)中應(yīng)用最為廣泛的一種綠色熒光素衍生物，其異硫氰酸基團(tuán)可與蛋白的氨基末端或者伯胺反應(yīng)從而實現(xiàn)包括抗體，凝集素在內(nèi)的蛋白標(biāo)記。除了用作蛋白質(zhì)標(biāo)記物，還可用作蛋白質(zhì)熒光示蹤劑，標(biāo)記抗體用以快速鑒定病原體，以及用于蛋白質(zhì)和多肽（HPLC）的微量測序。FITC為黃-橙色粉末，最大激發(fā)波長為494 nm。一旦激發(fā)，在最大發(fā)射波長520 nm處呈黃-綠色熒光。

標(biāo)記蛋白使用方法

1、制備溶于0.1 M碳酸鈉緩沖液（pH 9）的待交聯(lián)蛋白樣品，濃度≥2 mg/mL。

【注】：勿將碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液存放于0-5℃超過1周，其pH值會發(fā)生變化，建議現(xiàn)配現(xiàn)用。

待標(biāo)記的蛋白必須是未被污染蛋白，且溶解蛋白的緩沖液里不能含有疊氮鈉或胺類試劑，如Tris、甘氨酸，因為這些試劑會抑制標(biāo)記反應(yīng)。如果緩沖液里含有上述試劑，則需將該蛋白溶液在4℃下于PBS，pH 7.4 透析過夜；透析過程中如果pH值過高（＞8.0-8.5）會損害某些蛋白。

2、溶解FITC于無水DMSO配制成濃度為1 mg/mL的溶液。

【注】：于標(biāo)記實驗前新鮮配置FITC溶液，避光。

3、對于1 mL 蛋白溶液加入50 μLFITC溶液，可按照每次5 μL的量邊加邊輕輕攪拌蛋白溶液；

4、待所需FITC加入完畢，將反應(yīng)液于4℃避光孵育8 h；

5、加入NH4Cl使其終濃度至50 mM，4℃終止反應(yīng)2 h；

6、加入二甲苯青至濃度0.1%，甘油至濃度5%；         

7、通過大小孔徑合適的凝膠過濾層析分離排除未被結(jié)合的FITC，分離范圍在20，000至50，000（球蛋白例如抗體）。待凝膠柱平衡后，將以上反應(yīng)混合液從柱頂注入，打開凝膠柱，待其全部流入柱床后，加入PBS緩沖液。

此時，可以形成兩條帶：a，快速移動帶，也就是FITC-蛋白偶聯(lián)物，先被洗脫，通常于室內(nèi)光下可看到；b，慢速移動帶，也就是未結(jié)合蛋白的FITC和二甲苯青。僅僅在PBS緩沖液清洗后被洗脫出來。

8、于4℃避光儲存上述偶聯(lián)物，加入0.1%（w/v）疊氮化鈉作為一種防腐劑。若蛋白濃度較低（＜1 mg/mL），可加入1%BSA作為一種蛋白穩(wěn)定劑。

9、偶聯(lián)物中熒光素和蛋白的比值（F/P）可通過測定495 nm和280 nm處的吸光值來鑒定，F(xiàn)/P應(yīng)位于0.3-1.0。小于該比例則信號太低，高于該比例則背景太高。

熒光素/蛋白摩爾比（F/P）的測定

F/P摩爾比即熒光素蛋白偶聯(lián)物中FITC與蛋白質(zhì)的摩爾比。為了計算該值，首先需測定該偶聯(lián)物在280nm和495nm的吸光值：將已標(biāo)記蛋白樣品置于石英比色皿中，測得A280和A495，注意A280的值需在0.2-1.4之間，如在該范圍外，需調(diào)整相應(yīng)標(biāo)記樣品濃度。

實驗操作流程僅供參考，以上科研試劑新維創(chuàng)生物均可以提供。