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2023年09月21日 14:35 來源：新維創(chuàng)生物科技（重慶）有限公司
細(xì)胞增殖和細(xì)胞死亡間平衡的維持對多種細(xì)胞有機(jī)的發(fā)育與生命的維持至關(guān)重要，其失衡將導(dǎo)致各種疾病的發(fā)生.如：人類平均每天有 6×10（10）個(gè)新細(xì)胞生成，同時(shí)又接近同等數(shù)量的成熟細(xì)胞被機(jī)體清除.在細(xì)胞增殖及細(xì)胞凋亡間存在一種配對關(guān)系，因此區(qū)分活細(xì)胞和死細(xì)胞對研究生長條件的控制和細(xì)胞死亡過程都是十分重要的。
一．試劑準(zhǔn)備：
A. 活細(xì)胞-綠色染料（LiveDye）：冰上避光放置。
B. 死細(xì)胞-紅色染料（NucleiDye）：冰上避光放置。
C. 實(shí)驗(yàn)緩沖液 (10×) [Assay Buffer(10×)]：用 ddH20 稀釋 10x 實(shí)驗(yàn)緩沖液，至 1x 實(shí)驗(yàn)緩沖液（工作液）。使用前預(yù)熱到 37C。
D. 染色工作液：每 1 ml 的實(shí)驗(yàn)緩沖液（1X）中，加入 1ul 活細(xì)胞-綠色染料（LiveDye）和 1ul 死細(xì)胞-紅色染料（NucleiDye），混合均勻（適用于2個(gè)樣品孔，每孔0.5ml）。如有大量樣品，請成比例的擴(kuò)大染色工作液配置。
二．（一）熒光顯微鏡：
1. 用預(yù)期的方法處理細(xì)胞，在不含誘導(dǎo)劑條件下孵育細(xì)胞建立陰性對照組；
2. 對于貼壁細(xì)胞，在 24 孔板的蓋玻片上種植和培育細(xì)胞，在 CO2 細(xì)胞培養(yǎng)箱中 37°C 培養(yǎng)至少 24 小時(shí)。先用細(xì)胞刮刀或者胰酶-EDTA 消化細(xì)胞，之后離心收集細(xì)胞（1000 rpm，3 min）。
對于懸浮細(xì)胞，直接離心(4℃, 300g, 5 min）收集細(xì)胞。
3. 用 PBS 洗滌細(xì)胞兩次，移除液體。
4. 在 24 孔板中，每個(gè)孔加入 0.5ml 染色工作液來，37℃避光孵育 15-30 min。
5. 用 PBS 洗滌細(xì)胞兩次。
6. 將蓋玻片覆蓋到載玻片上，盡快使用適當(dāng)?shù)臑V光片通過熒光顯微鏡分析細(xì)胞。
為了獲得更佳效果，可以使用抗熒光淬滅劑對其進(jìn)行觀察。
（二）流式細(xì)胞分析：
1. 用預(yù)期的方法處理細(xì)胞
對于所有的處理和未處理的細(xì)胞樣本，建議把未染色的對照組細(xì)胞懸浮在實(shí)驗(yàn)緩沖液（不含有 LiveDye 和 NucleiDye），用于流式細(xì)胞分析；
2. 對于非貼壁細(xì)胞，收集 1-5 ×105 個(gè)細(xì)胞離心 (4℃, 300g, 5 min)，用預(yù)冷的 PBS 洗滌2 次，棄去 PBS。對于貼壁細(xì)胞，先用胰蛋白酶（不含 EDTA）消化細(xì)胞，然后離心去上清。
3. 用 500ul 染色工作液來懸浮細(xì)胞。
4. 避光孵育 15-30 min。
5. 使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行相應(yīng)檢測與分析。
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