吲哚菁綠標(biāo)記蛋白質(zhì)操作流程熒光染料icg

吲哚菁綠標(biāo)記蛋白質(zhì)操作流程
一、實(shí)驗(yàn)原理
吲哚菁綠（ICG）是一種三碳菁類(lèi)化合物，具有高熒光量子產(chǎn)率、激發(fā)波長(zhǎng)范圍寬、斯托克斯位移大、光穩(wěn)定性好、與蛋白質(zhì)結(jié)合后不易被蛋白酶水解等優(yōu)點(diǎn)，因而被廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)的熒光標(biāo)記。

本實(shí)驗(yàn)流程為：目的蛋白與吲哚菁綠反應(yīng)生成熒光標(biāo)記產(chǎn)物，通過(guò)PAGE或色譜等方法將產(chǎn)物分離，最后用熒光掃描儀檢測(cè)產(chǎn)物熒光信號(hào)。以下僅供參考。
二、實(shí)驗(yàn)步驟
1. 目的蛋白的制備：根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要，通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)或蛋白質(zhì)抽提等方法獲得所需目的蛋白。
2. 吲哚菁綠溶液的制備：將所需用量的吲哚菁綠溶于pH7.4的磷酸鹽緩沖液（PBS）中，濃度為100μM。
3. 目的蛋白與吲哚菁綠反應(yīng)：將目的蛋白與吲哚菁綠溶液混合，于室溫下反應(yīng)一定時(shí)間。
4. 分離純化：通過(guò)PAGE或色譜等方法將目的蛋白與吲哚菁綠反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行分離純化。PAGE具體步驟如下：制備10%的分離膠，將樣品在濃縮膠中充分混合之后上樣后染色4小時(shí)色。液染脫色后觀察目的蛋白是否被成功標(biāo)記。
5. 熒光掃描：將目的蛋白從聚丙烯酰胺凝膠中切下，用熒光掃描儀進(jìn)行掃描檢測(cè)，記錄熒光信號(hào)。

三、注意事項(xiàng)
1. 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中要嚴(yán)格控制溫度、pH值等反應(yīng)條件，以確保反應(yīng)的順利。

2. 進(jìn)行分離純化時(shí)需注意操作細(xì)節(jié)，保證凝膠和蛋白質(zhì)的質(zhì)量。
3. 在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中需避免熒光猝滅劑的污染，以確保檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。
4. 由于本方法涉及有毒物質(zhì)，需在專(zhuān)業(yè)指導(dǎo)下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作，并注意安全防護(hù)。
四、質(zhì)量控制
1. 在分離純化過(guò)程中應(yīng)設(shè)置對(duì)照實(shí)驗(yàn)，以驗(yàn)證目的蛋白是否被成功標(biāo)記。例如：將未標(biāo)記的目的蛋白與吲哚菁綠反應(yīng)液混合后進(jìn)行電泳或色譜分析，觀察對(duì)照實(shí)驗(yàn)中是否存在非特異性熒光信號(hào)。

2. 通過(guò)電泳法、光譜法等多種檢測(cè)方法，綜合評(píng)估實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。例如：利用光譜法測(cè)定吲哚菁綠的激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)，以驗(yàn)證其熒光性質(zhì)；通過(guò)電泳法觀察目的蛋白是否被成功標(biāo)記；利用熒光掃描儀檢測(cè)熒光信號(hào)強(qiáng)度等。

3.對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析處理，以得出更準(zhǔn)確可靠的數(shù)據(jù)。例如：利用分析軟件對(duì)電泳條帶進(jìn)行定量分析熒光信號(hào)強(qiáng)度；利用表格記錄數(shù)據(jù)并計(jì)算熒光信號(hào)的相對(duì)強(qiáng)度等。
五、應(yīng)用范圍
本方法可用于研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)功能與蛋白質(zhì)相互作用以及蛋白質(zhì)藥物篩選等領(lǐng)例域。例如：將目的蛋白與藥物分子作用后標(biāo)記吲哚菁綠，通過(guò)熒光掃描儀檢測(cè)熒光信號(hào)的變化，可研究藥物分子對(duì)蛋白質(zhì)的作用機(jī)制；將目的蛋白與特異性抗體結(jié)合后標(biāo)記吲哚菁綠，通過(guò)熒光掃描儀檢測(cè)熒光信號(hào)的變化，可應(yīng)用于蛋白質(zhì)免疫印跡等分析方法中；將多種蛋白質(zhì)混合后標(biāo)記吲哚菁綠，通過(guò)色譜或電泳等方法將各蛋白質(zhì)分離，再利用熒光掃描儀檢測(cè)各蛋白質(zhì)的熒光信號(hào)強(qiáng)度，可研究蛋白質(zhì)間的相互作用等。