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2023年10月14日 14:39 來源：新維創(chuàng)生物科技（重慶）有限公司
1、用不含氨基的合適的緩沖液（eg.100mM磷酸鈉，150mM NaCl, pH7.5）溶解抗體使其濃度達到1-5mg/mL?！咀ⅰ浚喝缈贵w中有殘留Tris或 glycine 污染，則需透析或者脫鹽到合適的緩沖液內(nèi)。
2、使用前，用適量去離子水或者無水DMSO溶解Cy3-NHS，使其摩爾濃度為抗體摩爾濃度的400倍，例如，待標記的IgG濃度為1mg/mL（eg 6.7μM），則溶解后Cy3-NHS的濃度為2.7mM；如待標記的IgG濃度為2.5mg/mL，則溶解后Cy3-NHS的濃度為6.75mM。
3、向抗體中加入適量Cy3-NHS試劑，以達到預期的標記效率。【注】：當用Cy3 NHS ester標記抗體或其他蛋白，亮度最高的偶聯(lián)物其染料/蛋白的比率為4-12，取決于特定的應用。過高比率會增加非特異性背景，喪失抗體特異性結(jié)合，導致聚集。建議根據(jù)應用優(yōu)化標記比率。
4、室溫孵育60min（或更長）。
5、利用合適緩沖液透析或脫鹽柱去除未反應的試劑。
6、分別在280nm和550nm檢測Cy3-抗體的吸光值。
7、測定Cy3標記效率（DOL）和標記濃度。
注意：可參考本方法進行多肽，蛋白或者其他分子的標記，需要根據(jù)具體的實驗體系對合適的標記緩沖體系，樣本濃度，染料濃度等參數(shù)做出合適的調(diào)整。以上科研試劑，新維創(chuàng)生物均可以提供。
應用舉例
用高于抗體摩爾濃度20倍的Cy3-NHS標記 0.1 mL山羊IgG（濃度為1mg/mL）。標記后脫鹽去除未標記染料，在PBS中測定(1:5稀釋)測定其A280和A555:
A280=0.2906
A555=0.9825
另：山羊IgG分子量為150kDa, E1%=13.6 or 204000M-1cm-1
計算DOL如下：
By Equation 2 Molarity of Cy3 dye=0.9825/150000 M-1cm-1=6.55μM
By Equation 3 Molarity of IgG =0.2906-(0.9825×0.08)/204000 M-1cm-1=1.039μM
By Equation 1 number of Cy3 per IgG=6.55μM/1.039μM=6.3
則計算Cy3-IgG protein 濃度為（mg/mL）：
By Equation 4 mg/ml=[0.2906-(0.9825×0.08)/1.36]×5=0.78mg/mL
新維創(chuàng)生物科技（重慶）有限公司
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