熒光染料如何標(biāo)記蛋白？以及使用過(guò)程中有哪些注意事項(xiàng)？

熒光標(biāo)記指將熒光物質(zhì)共價(jià)結(jié)合或物理吸附在所要研究分子的某個(gè)基團(tuán)上，具有無(wú)放射物污染、操作簡(jiǎn)便、容易觀察等優(yōu)點(diǎn)，可借助熒光特性對(duì)被標(biāo)記對(duì)象進(jìn)行定性、定位以及定量分析。熒光標(biāo)記在蛋白質(zhì)、核酸、細(xì)胞檢測(cè)及免疫分析等方面顯現(xiàn)出巨大潛能。

熒光染料如何標(biāo)記蛋白？以及使用過(guò)程中有哪些注意事項(xiàng)？

熒光染料標(biāo)記蛋白，主要包含以下步驟：

蛋白標(biāo)記時(shí)蛋白溶液的配制，以下幾點(diǎn)十分重要！  

1、關(guān)于溶解：溶解蛋白時(shí)，要根據(jù)推薦的溶劑進(jìn)行溶解，避免使用含伯胺 (例如 Tris，Glycine) 或銨離子的緩沖液，它們與待標(biāo)記蛋白會(huì)發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)降低標(biāo)記效率。低濃度的疊氮化鈉 (≤3 mM 或 0.02％) 或 Thimerosal (≤0.02 mM 或 0.01％) 不會(huì)顯著干擾蛋白標(biāo)記，但是 20-50％ 的甘油會(huì)降低標(biāo)記效率。

2、標(biāo)記蛋白濃度：蛋白濃度過(guò)低會(huì)大大影響標(biāo)記效率，一般濃度不小于 0.5 mg/mL。若蛋白濃度過(guò)低，可用超濾管濃縮蛋白。

注意事項(xiàng)：蛋白必須在不含伯胺和銨離子的緩沖液中，這些基團(tuán)會(huì)和蛋白爭(zhēng)奪結(jié)合位點(diǎn)，會(huì)影響標(biāo)記效率。

蛋白溶液配好了，我們現(xiàn)在開始配染料溶液，使用無(wú)水 DMSO 配制染料溶液 (多為 10 mM )，染料在 DMSO 穩(wěn)定性較好，剩余染料溶液可在 - 20℃ 分裝保存 1 個(gè)月。如果是水溶解，染料有易被水解的性質(zhì)，建議現(xiàn)配現(xiàn)用。

我們?cè)跇?biāo)記時(shí)，首要注意的是染料和蛋白的配比問(wèn)題，染料過(guò)少，反應(yīng)不完全，標(biāo)記量太少，染料過(guò)多，則不易純化。通常，我們推薦染料與蛋白的摩爾比在 5:1-20:1。

此處我們以 CY3 為例，假如所需標(biāo)記蛋白為 500 μL 2 mg/mL 的 IgG (MW=150,000)，用 100 μL DMSO 溶解一管 1 mg CY3 染料，則所需 CY3 體積為 3.95 μL，詳細(xì)計(jì)算流程如下：

1)mmol(IgG)=mg/mL(IgG)×mL(IgG)/MW(IgG): 2 mg/mL×0.5 mL/ 150,000 mg/mmol= 6.7×10-6 mmol

2)mmol(CY3)=mmol(IgG)×10: 6.7×10-6 mmol×10=6.7×10-5 mmol

3)μL(CY3)=mmol(CY3)×MW(CY3)/mg/μL(CY3): 6.7×10-5 mmol× 590.15 mg/mmol/0.01 mg/μL =3.95 μL 

了解配比后，我們開始孵育，一般將染料和蛋白一起室溫孵育 2 h 即可完成結(jié)合！

熒光標(biāo)記結(jié)束后，我們需要純化蛋白去掉多余未結(jié)合染料防止其對(duì)實(shí)驗(yàn)的干擾，常用的純化工具為親和層析柱和透析袋。

忙忙碌碌終于大功告成，那么如何檢測(cè)我們是否標(biāo)記成功呢，通常是以下幾種：

1、直接肉眼觀察，根據(jù)上面的純化原理可以得知，如果得到的產(chǎn)物有顏色。我們默認(rèn)標(biāo)記成功；

2、熒光顯微鏡觀察，通過(guò)熒光顯微鏡在對(duì)應(yīng)通道進(jìn)行拍攝，如果觀察到特定形態(tài)熒光信號(hào)即為標(biāo)記蛋白；

3、蛋白電泳實(shí)驗(yàn)，標(biāo)記后蛋白本身分子量會(huì)增大，蛋白存在微小向上拖帶可以證明標(biāo)記成功（如果向下大范圍拖帶可能是蛋白發(fā)生降解）。

4、使用分光光度計(jì)測(cè)定 F（熒光素）和 P（抗體蛋白）的比值（F/P），F(xiàn)/P 的比值反映熒光蛋白的特異性染色質(zhì)量，一般要求 F/P 的克分子比值為1～3。過(guò)高時(shí)，非特異性染色增強(qiáng)；過(guò)低時(shí)，熒光很弱，標(biāo)記效率低。