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2023年10月11日 14:11 來源：新維創(chuàng)生物科技（重慶）有限公司
異硫氰酸熒光素，具有高吸收率、優(yōu)良的熒光量子產(chǎn)率和良好的水溶性等特點，是生物學中應用最為廣泛的一種綠色熒光素衍生物，其異硫氰酸基團可與蛋白的氨基末端或者伯胺反應從而實現(xiàn)包括抗體，凝集素在內(nèi)的蛋白標記。除了用作蛋白質(zhì)標記物，還可用作蛋白質(zhì)熒光示蹤劑，標記抗體用以快速鑒定病原體，以及用于蛋白質(zhì)和多肽（HPLC）的微量測序。FITC為黃-橙色粉末，最大激發(fā)波長為494 nm。一旦激發(fā)，在最大發(fā)射波長520 nm處呈黃-綠色熒光。
標記蛋白使用方法
1、制備溶于0.1 M碳酸鈉緩沖液（pH 9）的待交聯(lián)蛋白樣品，濃度≥2 mg/mL。
【注】：勿將碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液存放于0-5℃超過1周，其pH值會發(fā)生變化，建議現(xiàn)配現(xiàn)用。
待標記的蛋白必須是未被污染蛋白，且溶解蛋白的緩沖液里不能含有疊氮鈉或胺類試劑，如Tris、甘氨酸，因為這些試劑會抑制標記反應。如果緩沖液里含有上述試劑，則需將該蛋白溶液在4℃下于PBS，pH 7.4 透析過夜；透析過程中如果pH值過高（＞8.0-8.5）會損害某些蛋白。
2、溶解FITC于無水DMSO配制成濃度為1 mg/mL的溶液。
【注】：于標記實驗前新鮮配置FITC溶液，避光。
3、對于1 mL 蛋白溶液加入50 μLFITC溶液，可按照每次5 μL的量邊加邊輕輕攪拌蛋白溶液；
4、待所需FITC加入完畢，將反應液于4℃避光孵育8 h；
5、加入NH4Cl使其終濃度至50 mM，4℃終止反應2 h；
6、加入二甲苯青至濃度0.1%，甘油至濃度5%；
7、通過大小孔徑合適的凝膠過濾層析分離排除未被結(jié)合的FITC，分離范圍在20，000至50，000（球蛋白例如抗體）。待凝膠柱平衡后，將以上反應混合液從柱頂注入，打開凝膠柱，待其全部流入柱床后，加入PBS緩沖液。
此時，可以形成兩條帶：a，快速移動帶，也就是FITC-蛋白偶聯(lián)物，先被洗脫，通常于室內(nèi)光下可看到；b，慢速移動帶，也就是未結(jié)合蛋白的FITC和二甲苯青。僅僅在PBS緩沖液清洗后被洗脫出來。
8、于4℃避光儲存上述偶聯(lián)物，加入0.1%（w/v）疊氮化鈉作為一種防腐劑。若蛋白濃度較低（＜1 mg/mL），可加入1%BSA作為一種蛋白穩(wěn)定劑。
9、偶聯(lián)物中熒光素和蛋白的比值（F/P）可通過測定495 nm和280 nm處的吸光值來鑒定，F(xiàn)/P應位于0.3-1.0。小于該比例則信號太低，高于該比例則背景太高。
熒光素/蛋白摩爾比（F/P）的測定
F/P摩爾比即熒光素蛋白偶聯(lián)物中FITC與蛋白質(zhì)的摩爾比。為了計算該值，首先需測定該偶聯(lián)物在280nm和495nm的吸光值：將已標記蛋白樣品置于石英比色皿中，測得A280和A495，注意A280的值需在0.2-1.4之間，如在該范圍外，需調(diào)整相應標記樣品濃度。
實驗操作流程僅供參考，以上科研試劑我們均可以提供。
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