羅丹明NHS 活化染料的常規(guī)標(biāo)記方法

以標(biāo)記高分子葡聚糖amino-dextran (40 kDa) 為例，講述羅丹明NHS 活化染料的常規(guī)標(biāo)記方法。對(duì)于特殊標(biāo)記條件和要求，可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)情況個(gè)體優(yōu)化。標(biāo)記準(zhǔn)備工作:

1反應(yīng)體系溶劑

標(biāo)記反應(yīng)可以采用純有機(jī)溶劑體系(比如 DMSO，染料和dextran 都可以很好的溶解于DMSO)或者有機(jī)溶劑/緩沖液混合體系(比如DMF/PBS利用DMF 助溶染料)。NHS 活化酷在微堿性條件下反應(yīng)的活性比較高，綜合考慮反應(yīng)速度和活化醋水解速度，一般選擇在 pH 7.0-8.5左右的 pH 值范圍進(jìn)行標(biāo)記反應(yīng)。最優(yōu)化的反應(yīng)緩沖鹽是 50 mM 的硼酸鈉溶液(50mM Na:BO,pH8.5)。除此以外，磷酸鈉緩沖鹽 PBS (0.1M Na;PO,0.15M NaCIpH7.2-7.5)NaHCO;溶液(0.M NaHCO,pH8.3-9.0)也可以用于標(biāo)記反應(yīng)。帶有氨基的緩沖液 (e.g.Tris 或甘氨酸)會(huì)自身和 NHS 活化反應(yīng)，所以不可使用，如果樣品中含有這些緩沖鹽，必須通過(guò)透析或者除鹽柱將這些氨基鹽除掉后才可以用于標(biāo)記反應(yīng)。由于 dextran 本身很穩(wěn)定，可耐受有機(jī)溶劑，本示例采用較高有機(jī)溶劑比例的 DMF/PBS(v/v=1/2)體系，以保證反應(yīng)體系中染料的完全溶解。

2染料母液配制

染料的 NHS 活化對(duì)濕氣很敏感。為了避免空氣中水汽在低溫樣品表面凝結(jié)失活樣品，低溫冰箱中取出的活化在室內(nèi)放置到室溫后再打開(kāi)瓶蓋使用。染料NHS 活化酯不建議配置母液，而是單次直接使用，如果母液有剩余，可短暫保存于低溫冰箱。羅丹明母液可以用DMF、DMSO、乙睛、甲醇等有機(jī)溶劑溶解，推薦母液濃度為 10mg/ml。母液也可以配制為 1mg/ml或者其它濃度，以便更準(zhǔn)確的移液操作。

3染料標(biāo)記比例 

為實(shí)現(xiàn)每個(gè)高分子標(biāo)記大于1個(gè)染料分子的目標(biāo)，在反應(yīng)體系中，染料/標(biāo)記對(duì)象的摩爾比例一般是 5-10/1;個(gè)別情況可以降低到約 3/1。為提高標(biāo)記效率，應(yīng)盡可能在高濃度、小反應(yīng)體積條件中進(jìn)行，比如標(biāo)記大分子 dextran，dextran 的濃度最好在 1-10mg/ml，或者更高。水溶液中的標(biāo)記反應(yīng)，就是 NHS 活化酯的水解反應(yīng)與氨基標(biāo)記反應(yīng)的賽跑，dextran 濃度高時(shí)，NHS 活化酯更多機(jī)會(huì)碰撞到氨基，反應(yīng)機(jī)會(huì)多，效率就高。

上述推薦比例僅僅是新維創(chuàng)生物提供的參考比例，具體比例需根據(jù)個(gè)人預(yù)實(shí)驗(yàn)摸索后決定，因?yàn)闃?biāo)記的效率與對(duì)象結(jié)構(gòu)、反應(yīng)體積、反應(yīng)溶劑、實(shí)驗(yàn)溫度、反應(yīng)時(shí)間和純化方式都有關(guān)系。標(biāo)記后以每個(gè)對(duì)象分子上偶聯(lián) 1-4 個(gè)染料為最佳(視標(biāo)記對(duì)象分子大小和實(shí)驗(yàn)需要而定)，標(biāo)記過(guò)多可能會(huì)影響穩(wěn)定性或者熒光淬滅，嚴(yán)重時(shí)會(huì)沉淀。標(biāo)記反應(yīng)步驟:

1將50mg amino-dextran 溶于 500 L的 PBS 中，將 dextran 溶液轉(zhuǎn)移到反應(yīng)小管中，用試劑檢測(cè)溶液 pH 值，以確保其為 pH - 7.4。

2根據(jù)染料/dextran標(biāo)記摩爾比例，取準(zhǔn)確體積的染料母液，補(bǔ)加DMF至250pL，與上述21步驟1中dextran 溶液混合，用移液器上下輕輕打動(dòng)混勻，或者輕微超聲 1-2秒，使染料完全溶解。常溫下靜置或翹班搖床輕微晃動(dòng)(更佳)，避光反應(yīng) 1-5小時(shí)，反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)有助于提高標(biāo)記效率，可標(biāo)記過(guò)夜。注意: 對(duì)于蛋白質(zhì)等敏感材料，反應(yīng)中的有機(jī)溶劑體積比最好控制在 5%以下，不建議超過(guò) 10%，反應(yīng)時(shí)間也可視情況縮短。

3利用透析法，除去未標(biāo)記的游離染料分子。透析前需對(duì)反應(yīng)樣品進(jìn)行預(yù)處理: 加入 15 m的 PBS 或者去離子水，反應(yīng)會(huì)出現(xiàn)沉淀，該沉淀為游離的羅丹明染料，加水后因?yàn)樗苄圆蛔愣恋沓鰜?lái)，而標(biāo)記產(chǎn)物 Rhod-dextran 水溶性強(qiáng)不會(huì)析出。10,000g 高速離心后取上清加入透析袋中透析。為了快速的透出染料分子，請(qǐng)采用至少截留分子量 >10KDa的透析袋常溫透析，最好每4個(gè)小時(shí)更換透析液，重復(fù)更換3次。隨著透析袋內(nèi) DMF溶劑分子的透出，可能會(huì)有更多的游離羅丹明染料分子沉淀出來(lái)，離心取上清換透析袋再透析，直到樣品沒(méi)有沉淀、無(wú)染料透出為止。凝膠過(guò)濾法，比如除鹽柱，也可以純化標(biāo)記產(chǎn)物，這個(gè)方法比較快捷，但是效率可能會(huì)不如透析法。

4在避光條件下，將純化后的 dextran 樣品儲(chǔ)存在4℃冰箱，可至1個(gè)月?；蛘叻?20℃冰箱，長(zhǎng)期保存。