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2023年11月20日 11:15 來源：新維創(chuàng)生物科技（重慶）有限公司
熒光染料FITC是如何標記蛋白質(zhì)的？以下是相應操作流程：
1)制備溶于0.1m碳酸鈉緩沖液(pH9.0)的待標蛋白溶液，濃度≥2mg/ml。
2)將FITC溶解在無水DMSO中，制成1mg/ml溶液。
3)將50μFITC溶液添加到1ml蛋白溶液中，可根據(jù)每次5μ量輕輕攪拌蛋白溶液。
4)加入所需FITC后，反應液在4°C避光孵化8h。
5)加入NH4CI，使其終濃度達到50mm，4°C終止反應2h。
6)加入二甲苯綠至0.1%，甘油至5%。
7)通過對尺寸和孔徑合適的凝膠過濾層進行分析和分離，排除未結(jié)合的FITC，分離范圍為2000-50000(球蛋白如抗體)。凝膠柱平衡后，從柱頂注入上述反應混合波。打開凝膠柱，流入柱床后加入PBS緩沖液。此時，可形成兩條帶：
a.快速移動帶，即FITC-蛋白質(zhì)標記物，首先被洗掉，通常在室內(nèi)光下可見;
b.慢速移動帶，即FITC和二=甲苯綠，沒有蛋白質(zhì)結(jié)合。僅在PBS緩沖液清洗后就被洗掉了。
8)將上述偶聯(lián)物儲存在4°C中，加入0.1%(w/v)疊氮化鈉作為防腐劑。如果蛋白質(zhì)濃度低(1mg/ml)，可以加入1%BSA作為蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑。
9)標記物中熒光素與蛋白質(zhì)的比值(F/P)可通過測量495nm和280nm處的吸光值來識別，F(xiàn)/P應位于0.3-1.0。如果比例小，信號太低，如果比例高，背景太高。
新維創(chuàng)生物科技（重慶）有限公司
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